Analisis Fragmen DNA Terklon Melalui Pemetaan Restriksi

Analisis fragmen DNA terklon melalui pemetaan restriksi – Mendapatkan peta restriksi untuk fragmen kloning biasanya penting sebelum manipulasi tambahan dapat dilakukan. Hal ini sangat penting ketika vektor fag atau kosmid telah digunakan untuk mengkloning potongan DNA yang relatif besar. Jika peta restriksi tersedia, fragmen yang lebih kecil dapat diisolasi dan digunakan untuk berbagai prosedur, termasuk subkloning ke vektor lainnya, persiapan probe untuk kromosom berjalan, dan sekuensing DNA. Jika protokol kloning telah dilibatkan penggunaan vektor bakteri atau YAC, dengan sisipan dalam berbagai ukuran dari 300-500 kb, maka yang disebut pemetaan restriksi jangka panjang mungkin diperlukan pada awalnya.

Dalam praktiknya, DNA kloning biasanya dipotong dengan berbagai enzim restriksi untuk menentukan jumlah fragmen yang dihasilkan oleh masing-masing enzim. Jika enzim memotong fragmen pada interval yang sering akan sulit untuk menguraikannya pada peta restriksi, sehingga enzim dengan banyak situs pemotongan sebaiknya dihindari. Enzim yang memotong DNA menjadi 2-4 potong biasanya dipilih untuk percobaan awal. Dengan melakukan serangkaian pemotongan tunggal dan ganda dengan berbagai enzim, peta restriksi lengkap dapat disatukan. Pemetaan restriksi memberikan informasi penting yang diperlukan untuk karakterisasi lebih rinci dari fragmen kloning.

Peta retriksi dari fragmen kloning penting diketahui sebelum manipulasi tambahan dilakukan. Hal ini penting khususnya untuk vektor fag atau kosmid yang digunakan untuk klone potongan DNA yang relatif besar. Jika peta retriksi tersedia, fragmen yang lebih kecil dapat diisolasi dan digunakan untuk berbagai prosedur, termasuk subkloning ke vektor lainnya, penyusunan probe kromosom berjalan dan sekuensing DNA. Jika protocol kloning melibatkan penggunaan vektor kromosom bakteri atau ragi buatan dengan  sisipan dalam berbagai ukuran dari 300-500 kb, maka yang disebut long-range retriction mapping mungkin diperlukan pada awalnya.

Dalam prakteknya, DNA kloning biasanya dipotong dengan berbagai enzim restriksi untuk menentukan jumlah fragmen yang diproduksi oleh masing-masing enzim. Jika enzim memotong fragmen pada interval yang sering akan sulit untuk menentukan peta restriksi, sehingga enzim  dengan beberapa situs pemotongan sebaiknya dihindari. Enzim yang memotong DNA menjadi dua sampai empat bagian biasanya dipilih untuk percobaan awal. Dengan melakukan serangkaian pemotongan dengan enzim tunggal dan multiple, peta retriksi lengkap dapat disatukan. Ini memberikan informasi penting yang diperlukan untuk karakterisasi fragmen cloning yang lebih rinci

Mendapatkan sebuah peta restriksi untuk fragmen yang akan di klon biasanya penting dilakukan sebelum masi tambahan dilakuakan. Hal ini merupakan bagian yang penting dimana phaga atau vektor cosmid ah digunakan untuk mengkloning DNA yang berukuran besar. Apabila dalam peta restriksi terdapat fragmen yang berukuran lebih kecil dapat diisolasi dan digunakan untuk bermacam-macam prosedur termasuk:

Subcloning ke dalam vektor lain

Persiapan DNA pelacak pada kromosom berjalan, dan Skuensing DNA atau penjajaran DNA.

DNA yang terklon biasanya dipotong oleh bermacam-macam  enzim restriksi untuk menentukan fragmen yang interval pemotongannya sering akan sulit untuk menguraikan peta restriksi sehingga sebaiknya dihindari.

Enzim restriksi yang memotong DNA menjadi 2-4 potongan biasanya yang sering digunakan dalam eksperimen. Peta restriksi digunakan untuk menyediakan informasi yang penting yang dibutuhkan untuk karakterisasi yang detail dari fragmen yang di klon.

Karena fungsi peta restriksi sangat penting untuk menyediakan informasi penting yang dibutuhkan untuk karakterisasi yang detail dari fragmen yang diklon sehingga sebaiknya pemotongan fragmen DNA tidak sering/ menggunakan enzim restriksi yang sedikit memotong fragmen DNA menjadi 2-4 potongan saja.

Informasi peta restriksi diperlukan ketika vektor fag atau kosmid yang digunakan dalam mengkarakterisasi fragmen kloning berukuran besar.  Peta restriksi penting digunakan untuk melakukan isolasi fragmen yang lebih kecil yang dapat digunakan untuk berbagai keperluan diantarannya subkloning ke vektor lain, penyusunan probe untuk kromosom berjalan dan sekuensing DNA.  Pemetaan jangka panjang dibutuhkan ketika protokol kloning yang dilibatkan, menggunakan vektor kromosom buatan seperti bakteri atau ragi dengan ukuran antara 300-500kb. Kloning DNA dipotong menggunakan beberapa enzim restriksi untuk mengetahui ukuran yang di hasilkan oleh masing-masing enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan sebaiknya enzim yang memotong DNA menjadi 2-4 bagian, sedangkan enzim yang terlalu banyak memotong fragmen DNA sebaiknya tidak digunakan, hal ini karena fragmen DNA yang terlalu pendek akan sulit untuk menguraikan peta restriksi dan dikhawatirkan akan memotong gen yang pembawa sifat yang diinginkan, sehingga gen akan menjadi tidak fungsional.  Pembutan peta restriksi dilakukan dengan pemotongan tunggal dan ganda atau kombinasinya. Pemotongan ganda atau kombinasinya dimaksudkan untuk menentukan orientasi pada fragmen yang dipotong.  Peta restriksi memberikan informasi penting yang dapat digunakan untuk karakterisasi lebih rinci fagmen terklon.

Baca artikel lain :

Analisis fragmen DNA terklon menggunakan metode hibridisasi Southern, northern, and western

Blotting adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi. Keuntungan teknik blot yakni akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau matriks. Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan. Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat lebih singkat. Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum dianalisis. Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode analisis yang dipakai. Matriks yang biasa dipakai dapat berupa nitroselulosa (NC) ataupun nylon. Namun NC juga memiliki kekurangan, yaitu beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat hilang selama pemrosesan.

Macam-macam metode Blotting yakni Southern Blotting yaitu teknik untuk mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya yaitu dengan menempatkan gel elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti spons yang telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk pula beberapa kertas peresap dan pemberat di atasnya. Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan ke membran, membawa molekul ke kertas membran. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat kita dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA tersebut. Kemudian ada Northern Blot yang merupakan teknik yang mirip dengan Southern Blot, namun digunakan untuk mendeteksi RNA. Sedangkan Western Blotting merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target. Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan sangat banyak protein lain, dapat memberikan informasi mengenai ukuran dan ekspresi protein tersebut.

Prinsip teknik blotting adalah teknik untuk mentransfer fragmen DNA dari gel ke membran seperti membran nitrocellulose ataupun membran nylon. Teknik blotting terdiri dari southern blotting, northern blotting, dot blotting/ slot blotting dan western blotting. Southern blotting, northern blotting dan western blotting menggunakan teknik elektroforesis karena menggunakan gel seperti agarosa sedangkan dot blotting/ slot blotting tidak ada proses elektroforesis karena langsung di tempel ke membran.

Pada teknik  Southern  blotting dibuat sebuah alat sederhana dengan susunan (dari bawah ke atas) larutan buffer, sebuah blok, kertas saring, gel agarosa yang sudah mengandung fragmen DNA yang sudah tervisualisasi oleh elektroforsis, membran nitrocellulose, kertas saring, kertas tissue dan pemberat. Pemberat berguna untuk mempercepat menempelnya fragmen DNA dari gel ke membran.  Fragmen-fragmen DNA yang sudah tervisualisasi pada gel agarosa diletakkan diatas kertas filter dan dibawah membran nitrocellulose sesuai urutan yang tadi dijelaskan selama kurang lebih 24 jam.

Setelah 24 jam dilakukan proses denaturasi dengan cara membran nylon yang sudah terdapat DNA dimasukan ke dalam plastik beserta buffer dan probe nya agar DNA dan probe sama-sama menjadi untai tunggal dan saling komplemen kemudian di inkubasi pada suhu 65-68oC selama 1 hari kemudian membran nylon diambil dan dicuci di air mengalir agar gen yang tidak berikatan dengan probe (bukan gen target) ikut terbuang oleh air. Lalu membran ditempel bersama X-ray film dan di autoradiograph kemudian dikeluarkan dan “dicuci” lalu dicocokan pada fragmen DNA pada gel agarosa sebelumnya.

Proses terakhir diamati enzim retriksi manakah yang sesuai. Pada kasus ini sumuran 2 tidak diberi enzim retriksi, sumuran 3 menggunakan EcoRI, sumuran 4 menggunakan PstI, sumuran 5 menggunakan BamHI, sumuran 1 dan 6 sebagai DNA marka. Hasil yang diperoleh setelah di autoradiograph sumuran 3 dan 5 masih terdapat 2 fragmen yang mungkin berarti pemotongan gen target oleh enzim retriksi EcoRI dan BamHI yang kurang tepat sehingga gen target terbagi menjadi dua. Pada sumuran 2, fragmen masih utuh dan masih berukuran 20 kb sedangkan sumuran 4 yang menggunakan PstI menghasilkan 1 fragmen yang berarti menunjukan itu adalah gen target yang tepat dan sesuai dengan ukuran 7 kb. Pada teknik Northern blotting prinsip dan mekanisme sama seperti Southern blotting hanya saja yang ditransfer ke membran nitrocellulose ataupun membran nylon adalah fragmen RNA bukan DNA.

Teknik blotting yaitu teknik pemindahan DNA/RNA dari gel ke membran

Teknik blotting dapat dibedakan menjadi 3 macam yaitu :

  1. Southern blotting yaitu teknik blotting yang digunakan untuk DNA genomic
  2. Nouthern blotting yaitu teknik blotting yang digunakan untuk RNA / cDNA
  3. Western blotting yaitu teknik blotting yang digunakan untuk protein.

Proses dari teknik southern blotting dapat dimulai dengan DNA diisolasi dari suatu sumber misalnya fragmen 20kb lalu dipotong dengan menggunakan enzim restriksi yang berbeda-beda. Fragmen yang mengandung muatan kemudian di elektroforesis dengan gel agarosa. Fragmen akan bergerak membuat salinan dan bergerak dari muatan negatif ke muatan positif. Setelah di elektroforesis dengan gel agarosa lalu hasil gel hasil elektroforesis di ambil dan diletakkan diatas larutan buffer. Susunan dari membrannya yaitu pertama terdapat larutan buffer – balok yang mendukung – kertas filter (nitrocelulosa/nylon) – gel – membran –  kertas filter – pemberat. Gel diletakkan di larutan buffer selama semalam agar fragmen terserap ke membran. Fungsi dari kertas filter tersebut untuk meningkatkan daya serap fragmen agar dapat menempel pada membran. Setelah fragmen menempel membran, fragmen yang double strand lalu di denaturasi terlebih dahulu dengan larutan alkali agar menjadi fragmen yang single strand. Kemudian membran dimasukkan ke dalam plastik dengan suhu diatur antara 65-68oC lalu ditambahkan dengan probe yang radioaktif. Tujuan dari pengaturan suhu yaitu agar probe dapat menentukan DNA targetnya. Setelah itu membran dikeluarkan dari plastik dan dilakukan pencucian.

Tujuan dari pencucian yaitu agar fragmen yang tidak ditempeli dengan probe akan tercuci sehingga hanya menyisakan fragmen yang ditempeli dengan probe saja. Setelah itu membran filter dikenakan pada X-ray film dengan teknik autoradiograph. Hasil dari autoradiograph berupa spot-spot fragmen yang memiliki susunan sama persis dengan hasil dari visualisasi elektroforesis. Perbedaannya pada teknik autoradiograph fragmennya telah mengandung probe. Pemotongan fragmen dengan menggunakan enzim restriksi yang berbeda juga menghasilkan panjang fragmen yang berbeda pula. Seperti terlihat pada gambar 8.10 fragmen yang terlihat pada setiap sumuran memiliki panjang fragmen yang berbeda-beda. Dari hasil autoradiograph yang memiliki hasil ideal ada pada sumuran nomer empat karena pada sumuran tersebut fragmen DNA yang tervisualisasi ada 2 sedangkan fragmen yang ditempeli dengan probe hanya ada 1. Hal ini sangat ideal karena probe hanya mampu mengenali satu DNA target saja. Sedangakan untuk prosedur kerja dari teknik nouthern blotting dan western blotting memiliki prosedur yang sama seperti teknik southern blotting.

analisis fragmen DNA terklon melalui pemetaan restriksi

Walaupun klon yang telah diidentifikasi  akan tetapi tidak dapat memberikan gambaran secara rinci struktur fragmen terklon dan gen yang dikandungnya, misalnya 20 kb fragmen DNA genomik yang telah dikloning didalam vektor pengganti dan gen yang diinginkan hanya berukuran 2 kb. Penentuan daerah yang diinginkan tersebut dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai metode berdasarkan blotting molekul asam nukleat ke membran yang disebut dengan Teknik Blotting dan hibridasi dengan probe khusus. Teknik Blotting dikembangkan pertama kali oleh Edwin M. Southern dan dikenal sebagai Southern Blotting.

Dalam metode ini fragmen DNA yang dipotong menggunakan enzim retriksi dielektroforesis pada gel agarosa. Setelah fragmen terpisah kemudian fragmen ditransfer ke membran nilon atau nitroselulosa dengan menggunakan teknik blotting. Pertama persiapkan wadah yang berisi cairan buffer transfer, letakkan support block, letakkan gel agarosa yang berisi fragmen, letakkan membrane nilon, letakkan filter paper wick, letakkan kertas tisu kemudian letakkan pemberat. Filter paper wick digunakan agar transfer buffer dapat bermigrasi ke arah gel menuju membran karena sifat kapilaritas. Kemudian didiamkan hingga fragmen yang terdapat pada gel menempel ke membran nilon. Setelah itu membran nilon didenaturasi agar hanya didapatkan untai tunggal DNA. Setelah itu membran dimasukkan kedalam plastik dicampur dengan probe yang dapat berupa radioaktif dan juga buffer lalu di inkubasi ± 65-80 0C, agar terjadi hibrid anatara DNA target dengan probe tersebut. Setelah diinkubasi membran di cuci untuk menghilangkan probe yang menempel pada tempat yang tidak spesifik. Setelah itu membran ditempelkan dengan kertas X-Ray.

Simpan

Simpan

Berkomentarlah dengan bijak,,No Spam !