Panduan Isolasi DNA (Deoxyribonucleic Acid)

Panduan Isolasi DNA ( Deoxyribonucleic Acid) – Semua organisme tersusun atas sel-sel, yang merupakan struktur fungsional terkecil dari suatu organisme. Berdasarkan jumlah sel penyusunnya, organisme dapat dibedakan atas organisme yang hanya terdiri atas satu sel (uniseluler) dan organisme yang terdiri atas banyak sel (multiseluler).

Setiap sel baik itu prokariotik, eukariotik, maupun archaea mempunyai informasi hereditas yang dikode oleh DNA. Eukariotik memiliki DNA berbentuk linier yang terdiri atas segmen-segmen dan terikat dengan protein untuk membentuk kromosom yang tersimpan di dalam nukleus. Berbeda dengan bentuk DNA eukariotik, DNA prokariotik  berbentuk sirkular untai ganda yang terletak di dalam sitoplasma.

Isolasi DNA merupakan proses pemisahan dan pengambilan molekul DNA dari sel serta materi intrasel lainnya. Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. Apabila terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik, maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan. Oleh sebab itu, isolasi DNA genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan.

Panduan Isolasi DNA (Deoxyribonucleic Acid)

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah buah strawberry, bawang bombay, buah naga, buah mangga, dan alpukat, detergen, NaCl, akuades, tenderizer, dan alkohol 96%.

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah kantung plastik, saringan dan kasa penyaring, tabung falcon, tabung Eppendorf, mikro sentrifuse, pipet tetes, dan penangas air.

Metode Mengisolasi DNA

Panduan Isolasi DNA (Deoxyribonucleic Acid)

Isolasi DNA buah

  1. Buah dimasukkan ke dalam kantung plastik, ditambahkan NaCl dan akuades, kemudian remas-remas hingga hancur.
  2. Detergen ditambahkan ke dalam kantung plastik.
  3. Saring lumatan buah dengan menggunakan saringan yang dilapisi kasa.
  4. Ambil hasil saringan sebanyak 2 ml menggunakan pipet, kemudian tampung di tabung falcon.
  5. Alkohol 96% sebanyak 2 ml ditambahkan ke dalam tabung
  6. Ada tidaknya DNA kromosom  yang berbentuk kabut putih diamati.
  7. Pindahkan ke tabung Eppendorf

Isolasi DNA bakteri

  1. Kultur cair E. Coli diambil sebanyak 1,5 ml ke dalam tabung Eppendorf, kemudian di sentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 5000 rpm.
  2. Setelah terbentuk endapan, supernatan dinbuang.
  3. Sebanyak  10 µL detergen dan 90 µL akuades ditambahkan. Dipanaskan selama 10 menit pada suhu 100ºC.
  4. Stelah itu, disentrifugasi kembali pada kecepatan 1200 rpm selama 10 menit.
  5. Endapan yang terbentuk merupakan sel yang lisis beserta remukan selnya, sedangkan DNA diduga berada di atas.

Baca Juga : Penjelasan Lengkap Genetika Bakteri

Penjelasan Tahapan Demi Tahapan

Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenan sel, (2) perusakan dan pembuangan dinding sel, (3) lisis sel, (4) pembuangan remukan sel, serta (5) pemisahan DNA dari protein dan RNA. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah diinkubasi sebelumnya. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan detergen atau sodium duodesil sulfat ( SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAase. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan,misalnya dengan penambahan ammonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi.

Fragmen-fragmen DNA yang telah diisolasi kemudian dielektroforesis, untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA. Elektroforesis merupakan teknik biologi sel untuk analisis DNA. Fragmen molekul DNA dapat ditentukan ukurannya melalui medium gel agarosa, suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut.

Elektroforesis dilakukan berdasarkan ukuran makromolekul, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Kecepatan gerak molekul pada elektroforesis bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya dan pada bentuk molekulnya. Fragmen yang kecil akan berjalan cepat, sedangkan fragmen yang berukuran lebih besar akan berjalan lebih lambat.

Tahap pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA bakteri adalah pemanenan sel untuk mendapatkan pelet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya. Setelah sel dipanen, dilakukan pelepasan DNA dari sel. Hal yang harus diperhatikan dalam tahap tersebut adalah sebagai berikut. Proses penghomogenan, harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif. Selain itu, setelah diberi fenol dan dibolak-balik seharusnya terdapat lendir jika tutup tube dibuka. Lebih baik semua tahap dilakukan di atas es yang telah diserut, untuk menjaga suhu supaya dingin. Pemberian bibiter bertujuan untuk mencerna dinding sel. SDS dapat melarutkan protein membran dan enzim. EDTA mengikat ion Mg2+ sehingga mendestabilisasi membran (karena ion Mg yang ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse.

Tahap selanjutnya adalah pemisahan dan pemekatan DNA. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama. Prinsip pemekatan DNA kromosom hampir sama dengan pemekatan plasmid. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. Etanol absolut dingin bertujuan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid.

Etanol dapat mempresipitasi DNA karena penambahan garam berfungsi sebagai penetral charge pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+, Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan – (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (air memiliki 2 muatan (+) pada H dan –pada O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. Fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tersebut. Atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. Selanjutnya, ditambahkan etanol 70% yang berguna untuk membersihkan lagi dan lebih memekatkan DNA.

Percobaan isolasi DNA pertama-tama bahan yang ingin diisolasi DNA nya dipecahkan dengan menambahkan enzim isozim dan larutan SDS yang berfungsi untuk memecah dinding atau membran sel. Dinding sel yang telah pecah menyebabkan organel-organel didalam sel keluar termasuk protein-protein yang terdapat didalam sitoplasma, sehingga DNA perlu dibersihkan dari pengotor-pengotor tersebut. Pembersihan pengotor pada DNA dilakukan dengan cara mengekstraksi larutan menggunakan campuran kloroform berbanding isoamil alkohol (24:1). Pengekstrakan dilakukan berulang kali sampai diperoleh larutan DNA yang relatif bebas protein.

Proses rekristalisasi molekul DNA dengan menggunakan etanol dapat mengakibatkan terbentuknya endapan yang dapat dilakukan dengan cara mencelupkan batang pengaduk ke dalam larutan, maka molekul DNA akan terlilit pada batang pengaduk tersebut. Hasil isolasi DNA yang didapat dari percobaan ini adalah seperti benang-benang halus yang berwarna putih. Benang-benang tersebut merupakan kumpulan DNA yang berbentuk kromatin. Kromatin terdiri dari sejumlah molekul DNA yang beruntai ganda yang sangat panjang dan massa protein dasar yang agak kecil serta hampir sama besarnya yang dinamakan histon disamping protein non histon dalam jumlah yang lebih sedikit (sebagian diantaranya bersifat asam dan berukuran lebih besar daripada histon) dan sejumlah kecil RNA. Heliks DNA berantai ganda dalam setiap kromosom memiliki panjang yang besarnya ribuan kali diameter nukleus sel. Salah satu tujuan molekul ini, khususnya histon adalah untuk memadatkan DNA.

Isolasi DNA tumbuhan dapat dilakukan dengan cara jaringan daun muda (100 mg) atau benih (30 mg) dihancurkan dengan mortir dan pestle ditambahkan nitrogen cair dan 0,7 ml larutan penyangga. ekstraksi dicampur dengan vortexing. Setiap sampel diinkubasi pada 65°C selama 20 menit dan 0,22 mL 5 M kalium asetat ditambahkan dan dicampur dengan baik. Tabung ditempatkan pada -20 ° C selama 30 menit, lalu disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 3 menit dalam sebuah microcentrifuge. Supernatan dipindahkan ke tabung baru. DNA  diendapkan dengan menambahkansebanyak  0,7 ml isopropanol, dicampur dengan baik, dan disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 3 menit. Supernatan dituang hingga habis dan pelet dibilas dengan etanol 70%. Pelet disuspensikan kembali dalam 300 µl T5E  dengan vortexing, inkubasi pada 65°C selama 5 menit, dan kembali vortexing. Kemudian, 150 uL 7,4 M amonium asetat ditambahkan dan dicampur dengan baik sebelum disentrifugasi selama 3menit dan penghapusan supernatan ke tabung baru. DNA diendapkan dengan mencampur dengan 330 µL isopropanol dan disentrifugasi selama 3 menit. Pelet dibilas dengan etanol 70% dan disuspensikan kembali dalam 100 µL T5E  dengan vortexing, inkubasi pada 65 ° C selama 5 menit, dan kembali vortexing. DNA kembali diendapkan dengan menambahkan 10 uL 3 M natrium asetat dan 75 uL isopropanol dan dicampur dengan baik, diikuti dengan sentrifugasi selama 3 menit. Pelet yang tersisa dicuci dengan etanol 70%  dan kemudian dikeringkan sebelum ditambahkan 25 µL TE. Larutan DNA disimpan pada -20 ° C sampai digunakan kembali.

Baca Juga Struktur Ultra Bakteri

Dapus

Albert, Brush. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Gramedia, Jakarta.

Anam, K. 2010. Laporan II –Isolasi DNA Genom. Institut Pertanian, Bogor.

Jusuf, M. 2001. Genetika I. Sagung Seto, Jakarta.

Mornkham. T, P.P. Wangsomnuk, P. Wangsomnuk, S. Jogloy, A. Pattanothai, Y.B. Fu. 2012. Comparison of Five DNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus).  Genetics and Molecular Research, 11 (1): 572-581.

Muttaqin M. 2010. Isolasi DNA Genom dan Polymerase Chain Reaction (PCR) GenPenyandi 16s rRNA. (http://biofin.wordpress.com/2011/03/17/isolasi-dna-genom-2/). Diakses tanggal 25 Mei 2012.

Raven and Johnson. 2001. Biology 5th edition. Mc-Graw Hill Company, New York.

Yatim, W. 2003. Kamus Biologi. Yayasan Obor Indonesia, Jakarta.

Yuwono, T. 2008. Biologi Molekuler. Erlangga, Jakarta.

Category: Ilmiah Tag:

About tohir

Ingin Belajar Sampai Dunia Alien, Bahwa berhenti belajar adalah kemunduran pemikiran. Tertarik pada hal baru yang mengundang penasaran.

Berkomentarlah dengan bijak,,No Spam !