Belajar Biologi Molekuler : PCR, Teknik Skrining, DNA dan RNA Yuk !

Belajar Biologi Molekuler PCR, Teknik Skrining, DNA dan RNA Yuk ! – Pada ulasan pertama, mari kita belajar tentang penggunaan PCR dalam teknik skrining.

Pada artikel sebelumnya telah diulas tentang PCR ( Polymerase chain reaction), silahkan bisa di baca terlebih dahulu. Setelah itu lanjut pada penjelasan di bawah ini:

Penggunaan PCR dalam teknik skrining

PCR telah memiliki efek yang sangat besar pada manipulasi gen dan biologi molekuler. PCR dapat digunakan sebagai metode skrining bank klon, meskipun ada metode tradisional yang lain untuk skrining perpustakaan yang mungkin lebih efisien. Meskipun PCR mudah untuk disiapkan, tetapi hal tersebut masih merupakan tugas yang berat jika klon yang harus diskrining terdiri dari beberapa ratus atau ribuan. Untuk dapat  mengatasi masalah ini, dan karena PCR sangat spesifik (dengan asumsi bahwa sepasang primer yang sesuai tersedia), sehingga dapat digunakan sebagai cara untuk mengidentifikasi klon tertentu. Salah satu cara untuk mereduksi atau mengurangi jumlah PCR individu adalah melakukan PCR dari sekumpulan kon. Cara ini dikenal sebagai skrining kombinatorial. Dasar teknik ini ditampilkan di gambar Sebanyak 8,6, di mana kita menganggap hasil klon yang telah dewasa dalam satu 96-well microtitre plate.

  1. a) pooling dari baris dan kolom klon. Baris A klon A1-A12 dikumpulkan dan dilakukan PCR tunggal. Hal tersebut juga dilakukan untuk kolom 1 (A1-H1). PCR tunggal dilakukan untuk setiap baris dan kolom yang dikumpulkan, dengan demikian, hanya 20 PCR yang diperlukan untuk 96- well microtitre plate (8 baris dan 12 kolom).
  2. b) hasil PCR positif ditunjukkan pada kolom 5 baris C, jadi kolon positif ada pada sumur C5, artinya kita sudah mendapatkan klon yang kita inginkan.
  3. c) hasilnya akan berbeda, jika hasil positif ada lebih dari satu yaitu pada baris D dan G dan kolom 6, dan 9. Dalam kasus ini empat klon (D6, D9, G6, dan G9) akan kembali diuji untuk menentukan klon positif yang diinginkan. Jika sampel klon memiliki jumlah yang lebih banyak, teknik ini dapat diperpanjang secara ‘vertical’ dengan menambahkan lebih banyak plate dengan susunan yang ditumpuk atau bertingkat. Kemudian dilakukan penyatuan atau pengumpulan klon dalam tiga dimensi (baris, kolom dan vertikal). Tujuan keseluruhan adalah untuk mencapai identifikasi khusus yang diinginkan.

Penggunaan PCR dalam skrining gen

PCR dapat digunakan untuk screening gen terklon. Namun pada dasarnya untuk mengetahui gen target dari klon yang ada kita harus melakukannya satu demi satu dari ratusan bahkan hingga ribuan kali reaksi PCR. Oleh karena itu dilakukan teknik combinatorial screening, tujuan dilakukan skrining kombinatorial yaitu untuk mengurangi reaksi PCR secara individual atau satu per satu reaksi PCR. Hal ini dapat dilakukan karena PCR bekerja dengan primer yang sangat spesifik. Jadi hanya primer tertentu yang kita inginkan saja yang dapat mengamplifikasi gen target yang diinginkan.

Dalam microtitre yang berisi 96 sumuran diisi dengan 96 klon yang berbeda. Diibaratkan kumpulan klon tersebut adalah perpustakaan gen. Dari 96 klon tersebut kita ingin mengetahui dimana gen target yang kita inginkan.

PCR

Klon dalam satu kolom atau satu baris hanya di PCR sekali saja dengan cara menyatukan klon-klon yang tersedia dalam suatu tabung PCR. Tabung 1 diisi kumpulan klon kolom ke-1 diisi dari 8 klon dibawahnya (1A-1H), tabung 2 diisi kumpulan klon kolom ke-2 (2A-2H), tabung 3 diisi kumpulan klon dari kolom ke-3 dari 8 klon dibawahnya (3A-3H), dst. Jadi akan ada 12 tabung dari tabung 1-12 yang masing-masing satu tabungnya berisi 8 klon yang mewakili satu kolom. Begitu juga dengan daerah baris, tabung A diisi kumpulan klon dari baris A dari 12 klon di sebelah kanannya (A1-A12), tabung B diisi kumpulan klon dari baris B dari 12 klon di sebelah kanannya (B1-B12), dst. Jadi akan ada 8 tabung dari tabung A-H yang masing masing satu tabungnya berisi 12 klon yang mewakili satu baris. Total ada 20 tabung yang siap di PCR, jadi kita tidak perlu melakukan 96 kali reaksi PCR satu demi satu, namun hanya melakukan 20 kali PCR.

Setelah dilakukan PCR dari 20 tabung, didapatkan hasil bahwa klon yang positif berada di kolom 5 dan baris C. Jadi klon yang positif mengandung gen target berada di sumuran 5C, atau di titik pertemuan antara baris C dan kolom 5.

pcr

Apabila hasil menunjukkan seperti pada Gambar 3, klon yang positif adalah klon pada sumuran D6,, D9, G6, dan G9, maka perlu dilakukan tes kembali dengan PCR untuk mementukan mana klon yang positif mengandung gen target.

Intinya dari skrining kombinatorial ini bertujuan untuk mengurangi reaksi PCR yang harus dilakukan untuk mendapatkan identifikasi yang spesifik.

PCR (Polymerase Chain Reaction) memiliki efek yang besar dalam memanipulasi gen dan ilmu biologi molekuler.  Screening bank klon dapat menggunakan dengan metode PCR, walaupun dalam beberapa kasus yang mana metode tradisiaonal lebih effisien dalam screening perpustakaan gen. Dalam penggunaannya PCR sangat mudah digunakan, namun apabila clon yang akan discreening terdapat lebih dari seratus ataupun mencapai seribu klon, itu merupakan tugas yang berat dalam mengaplikasikannya pada PCR. Bagaimanapun masalahnya PCR tetap digunakan karena PCR mempunyai sifat yg spesifik dalam menscreening klon, karena PCR memiliki primer yang sangat beguna dalam identifikasi clon.

Metode kombinatorial screening merupakan salah satu jalan dalam mereduksi jumlah PCR itu sendiri dengan cara mengumpulkan bagian sampel dari klon. Jadi prinsip nya itu mengumpulkan klon berdasarkan baris dan kolom yang terdapat pada mikrotiter tunggal 96 sumuran yang mana apabila dikumpulkan dari 96 sumuran dibagi menjadi 12 kolom dan 8 baris.  Jadi total yang seharusnya  dari 96 reaksi  yang terjadi direduksi menjadi 20 reaksi yang mana ini memeprmudahkan dalam melakukan PCR. Apabila didapatkan hasil pada mikrotiter nya hanya terdapat satu titik temu maka DNA yang diinginkan sudah didapat dan apabila terdapat dua titik temu makan harus dilakukan PCR kembali sampai mendapatkan satu titik temu.

PCR dapat digunakan untuk menyeleksi perpustakaan klon

Seperti kita tahu, PCR merupakan reaksi polimerasi berantai. PCR ini dapat berfungsi sebagai mentode penyeleksi klon. Ratusan bahkan ribuan klon harus diseleksi untuk keperluan biologi molekuler. Pekerjaan penyeleksian itu tidak mudah. PCR ini bisa memudahkan pekerjaan menyeleksi ratusan dan ribuan klon tadi, karena PCR bekerja secara spesifik dan tersedianya primer. Salah satu caranya adalah mereduksi PCR dengan teknik “combinatorial screening”, yaitu teknik mereduksi PCR dengan cara :

  1. Pada 96 mikrotiter, perbaris dan perkolom dikumpulkan menjadi satu. Jadi pada baris berjumlah 12 dan pada kolom berjumlah 8. Sehingga reaksi PCR menjadi 20.
  2. Setelah di running, kemudian dihasilkan satu single positif (titik temu antara kolom5 dan baris C). Maka satu sigle positif itulah yang dicari.
  3. Tetapi, apabila setelah di running menunjukkan hasil 4 single positif (4 titik temu yaitu D5,D9,G5,G9). Maka dilakukan tes kembali sampai menghasilkan satu single positif.

PCR (Polymerase Chain Reaction) memiliki efek yang besar dalam memanipulasi gen dan ilmu biologi molekuler.  PCR dapat digunakan untuk metode skrining klon bank, walaupun sebenrarnya ada beberapa metode tradisional yang lebih efisien digunakan. Meskipun PCR mudah dilakukan, tetap saja menjadi suatu pekerjaan yang sulit apabila harus melakukan skrining pada ratusan bahkan ribuan klon, tetapi karena PCR sangat spesifik (karena tersedia pasangan primer yang cocok dan juga spesifik) maka penggunaan PCR untuk mengidentifikaasi klon tetap dilakukan walaupun terdapat kesulitan tersebut.

Cara untuk mengatasi masalah tersebut adalah dengan mereduksi reaksi PCR, metode in i dikenal dengan Skrining Rekombinatorial. Skringing rekombinatorial dilakukan dengan cara mengumpulkan klon dari well microtitre sehingga apabila kita melakukan reaksi PCR pada mikrotiter 96 sumuran (Single 96 well microtitre plate) reaksi PCR yang kita lakukan tidak berjumlah 96 reaksi tetapi hanya 20 reaksi. Pengumpulan klon dilakukan dari baris dan kolom mikrotiter. Baris klon A dikumpulkan (A1-A12) kemudian PCR tunggal dilakukan begitu juga dengan kolom klon 1 (A1-H1), sehingga akan diperoleh 12 reaksi PCR dari masing-masing baris dan 8 reaksi PCR dari masing-masing kolom dan diperoleh reaksi PCR sebanyak 20 reaksi. Hasil positif dari reaksi PCR adalah munculnya satu titik temu pada baris dan kolom, contohnya pada kolom C baris ke 5, hal tersebut menunjukkan klon yang kita inginkan. Apabila titik temu atau interseksi yang kita dapatkan lebih dari 1 titik, misalnya 4 titik maka kita harus melakukan PCR ulang sampai kita mendapatkan hasil positif sebanyak 1 interseksi saja.

Berkomentarlah dengan bijak,,No Spam !