Teknik Immunological Screening Untuk Ekspresi Gen

Teknik Immunological Screening Untuk Ekspresi Gen – Sebuah alternatif untuk skrining menggunakan pelacak asam nukleat untuk mengidentifikasi produk protein dengan klon gen menggunakan immunological screening. Teknik ini diperlukan protein yang dinyatakan dalam rekombinan / teknik ini diperlukan untuk mengekspresikan protein di dalam rekombinan, dan yang paling sering digunakan untuk skrining ekspresi perpustakaan cDNA tersusun di dalam vektor seperti λgt11.

Bukan hanya sebuah probe asam nukleat, dibutuhkan sebuah antibodi spesifik. Antibodi diproduksi oleh hewan dalam respon terhadap antigen, yang biasanya merupakan protein murni. Ada dua tipe preparasi antibodi yang dapat digunakan. Yang paling umum adalah antibodi polyclonal. Biasanya dapat dijumpai dalam kelinci dengan menyuntikkan antigen dan menghilangkan darah sampel setelah respon imun terjadi. Fraksi immunoglobin dari serum dimurnikan, dan digunakan sebagai persiapan antiserum. Antisera polyclonal mengandung antibodi penentu faktor antigenik dari antigen. Sebuah antibodi yang lebih spesifik dapat diperoleh dengan menyiapkan antibodi monoklonal, yang merupakan antigenik tunggal. Namun, ini dapat menjadi kelemahan dalam beberapa kasus. Selain itu, produksi antibodi monoklonal adalah sebuah teknik unik dalam prakteknya. Dan polyclonal antisera yang berkualitas baik sudah cukup untuk tujuan skrining.

Terdapat berbagai metode yang tersedia untuk skrining imunologi, tetapi teknik yang sering digunakan yaitu dikenal dengan ‘plaque lift’ skrining dengan probe asam nukleat (Fig. 8.7). Klon cdna λ gt11 yang rekombinan akan mengekspresikan sekuen klon sebagai β galaktosa bergabung dengn protein, dengan asumsi bahwa urutan susunannya benar dalam rangkaian pembacannya. Protein dapat terangkat oleh membran selulosa dan bergabung dengan antibodi. Deteksi dapat dilakukan dengan berbagai metode, umumnya menggunakan sebuah ikatan molekul lain yang tidak spesifik seperti protein bakteri, atau antibodi lain, yang menambahkan ke dalam rantai primer antibodi yang spesifik. Deteksi bisa juga dengan metode tanpa radioaktif, yang hasilnya akan berwarna.

Skrining Immunologi untuk gen yang terekspresi

Screening aalah proses untuk mengidentifikasi suatu klon yang membawa gen tertentu yang di inginkan. Salah satu alternative skrining yang di gunakan untu mengidentifikasi produk protein adalah skrining immunologi atau skrining antibody. Skrining antibody dapat di gunakan ketika antibody spesifik tersedia. Tujuan dari diadakannya skrining immunologi adalah untuk menseleksi klon-klon yang di peroleh dengan syarat DNA yang di kloning harus menghasilkan protein tertentu dan adanya reaksi immunologis yaitu reaksi antibody dengan antigen.

Antibodi di produksi oleh hewan dalam merespon ancaman dari antigen. Ada dua tipe utama dalam preparasi antibody yang dapat di gunakan. Yang paling sering di gunakan adalah Poliklonal antibody, yang biasanya di digunakan pada kelinci dengan cara menginjeksikan antigen kemudian mengambil sampel darah setelah respon imun terjadi, dan di dapatkan antiserum. Antibodi yang lebih spesifik bisa didapatkan dengan cara preparing Monoklonal antibody. Walaupun begitu, cara ini memiliki kelemahan pada beberapa kasus. Dalam memproduksi monoclonal antibody teknik yang di guankan rumit, dan diperlukan antiserum yang kualitasnya bagus agar didapatkan hasil sesuai dengan tujuan skrining.

Ada banyak macam metode yang tersedia untuk skrining immunologi, tetapi teknik yang paling sering di gunakan adalah teknik  skrining ‘plaque lift’ dengan probe asam nukleat. Protein dipidahkan ke membrane nitroselulosa kemudian di tambahkan pelacar. Setelah itu, dilabeli dengan Isotop-125 dengan tujuan untuk menginterpretasikan protein yang di cari lalu di autoradiography. Deteksi bias dilakukan oleh label radioaktif ( protein A yang terlabeli I-125, atau antibody sekunder) atau metode non-radioaktif yang akan memproduksi produk yang terwarnai.

menjelaskan analisis fragmen DNA terklon menggunakan metode hybrid-arrest translation (HART) and hybrid-release translation (HRT)

Pencocokan sekuens kloning dengan protein encode dapat digunakan untuk mengidentifikasi klon yang dilakukan dengan dua metode: ‘hybrid-arrest’ and ‘hybrid-release’ translation.

Setelah klon telah diidentifikasi oleh teknik seperti hibridisasi (menggunakan pelacak asam nukleat yang dapat dilihat adanya ekspresi protein/tidak) atau skrining imunologi (menggunakan reaksi antibody dan antigen), selanjutnya dapat dilakukan karakterisasi yang lebih rinci tentang DNA. Karakterisasi tergantung pada apa yang sudah diketahui tentang gen yang bersangkutan, dan pada tujuan akhir dari percobaan.

Dalam beberapa kasus identitas klon tertentu memerlukan konfirmasi karena hasilnya yang ambigu dan tidak dapat memberikan identifikasi definitif, seperti yang terjadi pada metode skrining plus/minus. Hal ini membutuhkan uji lebih lanjut untuk mengidentifikasi produk protein dengan syarat protein telah dikarakterisasi. Ada dua metode yang dikenal sebagai hybrid-arrest translation (HART) dan hybrid-release translation (HRT), menggambarkan bagaimana suatu masalah tertentu dapat diatasi dengan dua variasi metoda yang berbeda dari tema yang sama (untuk mengidentifikasi produk protein dari sebuah fragmen cloning).

Baik metode HART maupun HRT, keduanya mengandalkan hybridisasi fragmen DNA kloning dengan mRNA dari jenis sel atau jaringan dari mana klon berasal. Dalam HART, sekuen kloning memblok mRNA dan mencegah translasi pada translasi In Vitro. Dalam HRT, sekuen kloning tidak dapat bergerak karena telah tertempel pada membran filter dan digunakan untuk memilih mRNA klon-spesifik dari genome mRNA keseluruhan. Hibridisasi antara mRNA dengan sekuen kloning dilepaskan dan ditranslasi secara in vitro. Jika asam amino radioaktif (biasanya [35S] metionin) dimasukkan ke dalam campuran translasi, protein yang disintesis dari mRNA (s) akan terlabeli dan dapat dideteksi oleh autoradiografi atau fluorography setelah elektroforesis gel SDSpolyacrylamid. Dalam HART, satu pita protein harus absen, sementara di HRT harus ada satu pita protein. Dengan demikian, HRT memberikan hasil bersih daripada HART.

Perbedaan proses HART dan HRT:

Gambar 6 pcr

Dua metode yang digunakan untuk mengidentifikasi produk Protein yang dihasilkan dalam translasi mRNA secara in vitro adalah HART (hybrid-arrest translation) dan HRT (hybrid-release translation). HART merupakan proses dimana produk protein tidak bisa ditranslasi lantaran mRNA masih dihybrid oleh cDNA, sehingga mRNA tidak bisa pada saat di autoradiogram pita mRNA tidak nampak karena masih dihybrid oleh cDNA. Beda dengan metode HRT yang dimana cDNA yang terikat dalam filter mendekati sekumpulan mRNA dari total mRNA yang ada, namun hanya satu mRNA yang dapat kedalam filter yang ada cDNAnya. mRNA yang berada diluar filter cDNA akan diremoved sehingga hanya tersisa sepasang mRNA dan cDNA dalam filter. Karena mRNA dan cDNA masih dalam keadaan komplemen sehingga mRNA dan cDNA dipanaskan agar terpisah supaya dapat di translasi. Setelah terlepas mRNA ditranslasi dalam autoradiogram untuk mengetahui protein yang dihasilkan dan saat di autoradiogram hanya akan terdapat satu pita, karena hanya satu mRNA yang ditranslasi.

Setelah hasil kloning diidentifikasi menggunakan teknik hibridisasi ataupun screening immunologic, karakterisasi yang lebih detail dapat dilanjutkan karena pada beberapa kasus, hasil kloning harus dilakukan konfirmasi. Ini karena pada metode plus/minus sering terjadi keambiguan dan tidak memberikan identifikasi secara jelas. Oleh karena itu, diperukan adanya karakterisasi lebih lanjut. Karakterisasi lebih lanjut dapat dilakukan dengan cara mengidentifikasi produk protein, dimana dapat dilakukan dengan dua metode yaitu HART dan HRT. Perbedaan mendasar dari kedua metode ini yaitu ada tidaknya pengikatan Mrna oleh cloned DNA. Pada metode HART (Hybrid arrest translation), cloned DNA memblok mRNA melalui hibrid (pengikatan) sehingga Mrna tercegah untuk mengalami translasi.

Ketika hasil metode HART di elektroforesis, akan terdapat 1 pita yang tidak terlihat/muncul, hal ini dikarenakan cloned DNA hibrid dengan mrna sehingga akan mencegah translasi. Sedangkan pada metode HRT atau hybrid release translation, cloned DNA akan di ikat pada suatu filter, kemudian salah satu mrna hybrid dengan cloned DNA di dalam suatu filter, setelah dilakukan proses washing/pencucian, mrna akan merelease melalui proses pemanasan. Ketika hasil metode HRT di elektroforesis, hasilnya hanya terdapat 1 pita yang muncul yaitu hasil release mrna yang mengalami transalasi in vitro setelah pelepasannya dengan cloned DNA. Dari kedua metode ini, metode HRT lebih rumit karena menggunakan labelling radioaktif tetapi metode HRT memberikan hasil yang murni dan sering dignakan daripada metode HART.

Tujuan dari pembuatan DNA rekombinan adalah untuk menyisipkan DNA yang kita inginkan ke dalamnya. DNA rekombinan yang telah disisipi kemudian ditanasformasikan ke dalam sel inang untuk memperbanyak rekombinan tersebut melalui proses kloning. Setelah mengalami replikasi intraseluler maka diperoleh berbagai kopian fragment-fragmen DNA. Akan tetapi, tidak semua hasil kloningan tersebut mengandung fragmen DNA yang benar kita inginkan dan kita sisipkan pada tahap berikutnya. Oleh karenanya, disini dierlukan suatu perlakuan lebih lanjut yakni seleksi, skrining, dan analisis.

Proses seleksi dan skrining sudah dijelaskan pada materi sebelumnya. Proses seleksi yang diikuti dengan proses skrining tersebut belum dapat menghasilkan data yang spesifik, maka diperlukan suatu analisis untuk mengkonfirmasi ulang dan memastikan bahwa di kloning-kloning tersebut terdapat fragmen DNA yang kita inginkan. Terdapat dua pendekatan yang dapat digunakan untuk menganalisisnya, yaitu Hybrid arrest hybridization dan Hybrid release hybridization. Kedua metode tersebut tidak jauh berbeda, sama-sama memiliki prinsip dasar yaitu hibridisasi antara fragmen pelacak dan fragmen yang ingin kita lacak.

Hybrid arrest hybridization dilakukan dengan mencampurkan fragmen DNA yang kita duga adalah fragmen DNA yang kita inginkan, dengan sejumlah mRNA yang berasal dari sumber yang sama dengan fragmen DNA yang kita sisipkan, bisa berasal dari sel maupun jaringan yang sama. Setelah dicampurkan, maka fragmen DNA yang kita duga tersebut akan terhibridisasi oleh mRNA yang komplemen, sehingga terbentuk satu pita ganda yakni hasil hybrid DNA dan mRNA. Kemudian campuran tersebut ditranslasi secara in vitro (diluar jaringan hidup, bisa di dalam medium tertentu).

Hanya fragmen yang bersifat untai tunggal lah yang dapat ditranslasikan. Oleh karenanya di metode ini terdapat satu mRNA yang tidak tertranslasi, karena terblok oleh DNA yang kita duga tersebut, sehingga ketika dielektroforesis dengan menggunakan gel polyacrilamid terdapat satu pita protein yang tidak muncul. Sedangkan, untuk metode  Hybrid release hybridization tidak jauh berbeda. Pada metode ini, DNA yang kita duga dilekatkan terlebih dahulu dalam suatu membrane dan tetap dicampurkan dengan sejumlah mRNA dari sumber yang sama, sehingga mRNA yang komplemen akan menghibrid DNA tersebut di dalam membrane. Setelah itu, mRNA sisanya dihilangkan dari campuran menggunakan suatu larutan buffer, dan untai ganda hasil hybrid dilepaskan dengan perlakuan denaturasi atau pemanasan. Kemudian mRNA tersebut (yang menghibrid DNA) ditranslasi secara in vitro dan dielektroforesis di gel polyacrilamid, sehingga hanya aka nada satu pita protein yang muncul.

Perbedaan dari kedua metode tersebut adalah pada Hybrid arrest hybridization akan terdapat satu pita protein yang tidak muncul, hal ini akan mempersulit dalam pembacaan hasil elektroforesis, terlebih lagi apabila proses kerja dilakukan dengan kurang tepat. Hybrid release hybridization menghasilkan gambaran yang lebih jelas, karena hanya ada satu pita yang muncul setelah dielektroforesis. Sayangnya, kedua metode ini sudah lama tidak digunakan lagi, karena melalui metode ini belum dapat memastikan bahwa fragmen DNA yang kita curigai tersebut mengandung suatu gen yang utuh atau hanya sebagian saja, walaupun metode ini sudah dapat member gambaran awal tentang kandungan gen tertentu dalam fragmen DNA yang kita curigai tersebut.

Baca juga :

Berkomentarlah dengan bijak,,No Spam !